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本制品是一种采用7-AAD染色法进行细胞周期检测的试剂盒，通过流式细胞仪进行分析。本试剂盒通常用于贴壁细胞或悬浮细胞的细胞周期检测。对于组织样品，需经消化成单细胞后才可用此试剂盒进行检测。

7-AAD是一种不具有膜渗透性的DNA结合染料（选择性插入DNA的GC富集区），通常被活细胞排除在外。活细胞和早期凋亡细胞排斥7-AAD不被染色，但具损伤质膜或受损/无代谢活动的细胞无法阻挡染料进入而被染色。7-AAD/DNA复合物能被488nm的氩离子激发器，发生大的斯托克斯迁移，最大发射波长在647nm。细胞经7-AAD染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么，含双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度介于1～2。

• 因7-AAD也能结合RNA，因此，试剂盒内提供RNase A用来降解RNA，以降低背景荧光。然而，虽有资料显示，7-AAD不和RNA结合，但从我司的实验数据来看，添加RNase处理的效果更好。
  
• 因7-AAD不具有细胞膜渗透性，则需先对细胞进行乙醇固定，再进行后续染色。
  
• 请自行准备95%乙醇和PBS。
  
• 荧光染料均存在荧光淬灭，保存和使用过程中请注意避光，以减缓淬灭。
  
• 因7-AAD对人体有刺激性，请注意适当防护。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 细胞样品的准备：每个样品的细胞数量可以为500万以上。
  
  • 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。用胰酶消化细胞，直至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心3～5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50μL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
    
  • 对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50μL左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
    
  • 对于组织样本：用剪刀将组织剪成尽量小的小块后，用0.25%胰酶消化30～60min（或根据实际情况选择适当的混合酶来进行组织消化），经过200-400目细胞筛网过滤得到单细胞悬液。然后参照步骤1b对于悬浮细胞来准备样品。
• 细胞固定：取4mL冰浴预冷的95%乙醇，一边低速涡旋震荡的同时逐滴加入1mL细胞悬液（冰上操作），混匀后于4℃固定2h或更长时间，固定12～24h可能效果更佳。1500rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50μL左右的乙醇固定液，以避免吸走细胞。加入约5mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹动离心管底以分散细胞避免细胞成团。
  
• 7-AAD染色工作液的配制：参照下表根据实际检测样本的数量配制足量的7-AAD染色工作液。
  

  成分	1个样品	5个样品	10个样品
  染色缓冲液	0.1mL	0.5mL	1.0mL
  25×7-AAD染色液	4μL	20μL	40μL
  50×RNase A	2μL	10μL	20μL

  • 7-AAD染色工作液短时间可4℃保存，但需当日使用。
• 染色：每管细胞样品中加入0.1mL 7-AAD染色工作液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光孵育30min。随后可置于4℃或冰浴避光存放。
  
• 加入2mL PBS，1500rpm离心5min，去上清。
  
• 加入500μL PBS，流式细胞仪上机检测。
  
  • 请在24h内完成流式检测，最好能在当天完成流式检测。
• 流式检测与分析：用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光（7-AAD通道或PerCP通道），同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行DNA含量和光散射分析。
  
  • 上机时，荧光通道设置为线性放大（Linear Scale）。